以液體作流動相的色譜法。氣相色譜法隻適合分析較易揮發，且熱穩定性好的有機化合物。液相色譜法則適合於分析那些用氣相色譜法難分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質，其應用範圍已經遠遠超過氣相色譜法，居色譜法之首。
HPLC按分離機理的分類| 類 型 | 主要分離機理 | 主要分析對象或應用領域 |
|---|---|---|
| 吸附色譜法 | 吸附能，氫鍵 | 異構體分離、族分離，制備 |
| 分配色譜法 | 疏水分配作用 | 各種有機化合物的分離、分析與制備 |
| 凝膠色譜法 | 溶質分子大小 | 高分子分離、分子量及其分佈的測定 |
| 離子交換色譜法 | 庫侖力 | 無機離子、有機離子分析 |
| 離子排斥色譜法 | 唐南平衡 | 有機酸、氨基酸、醇、醛分析 |
| 離子對色譜法 | 疏水分配作用 | 離子性物質分析 |
| 疏水作用色譜法 | 疏水分配作用 | 蛋白質分離與純化 |
| 手性色譜法 | 立體效應 | 手性異構體分離，藥物純化 |
| 親和色譜法 | 生化特異親和力 | 蛋白、酶、抗體分離，生物和醫藥分析 |
簡史 在各種色譜法中，液相色譜法(LC)是最早(1903)發明的，但其初期發展比較慢，在LC普及之前，紙色譜法(PC)、氣相色譜法(GC)和薄層色譜法(TLC)是色譜法的主流。到瞭20世紀60年代後期，將已經發展得比較成熟的GC的理論與技術應用到LC上來，使LC得到瞭迅速的發展。特別是填料制備技術、檢測技術和高壓輸液泵性能的不斷改進，使LC分析實現瞭高效化和高速化。具有這些優良性能的液相色譜儀於1969年商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的LC就被稱為高效液相色譜法(HPLC)，又稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法。
分類 廣義地講，固定相為平面狀的紙色譜法和薄層色譜法也是以液體為流動相，也應歸於LC。不過通常所說的液相色譜法僅指所用固定相為柱型的柱液相色譜法。根據固定相的不同，LC分為液–固色譜法、液–液色譜法和鍵合相色譜法。應用最廣的是以矽膠為填料的液–固色譜法和以微粒矽膠為基質的鍵合相色譜法。按分離機理可以將液相色譜法分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。高效液相色譜法(HPLC)按分離機理的分類見表。
原理 LC的基本原理與GC基本相同，不同點在於：LC中溶質的擴散系數為GC的萬分之一到十萬分之一；LC所用流動相的黏度比GC大100倍左右；LC的流動相的組成對柱內吸附分配平衡的影響很大，常成為選擇分離條件的主要因素，而GC的流動相對分離過程的影響一般可以忽略。不同類型LC的分離機理是有差異的，在此僅對幾種主要的LC分離模式做進一步闡述。
吸附色譜法 基於被測組分在固定相表面具有吸附作用，且各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留而實現分離。其固定相通常是活性矽膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑，所以吸附色譜法也稱液–固吸附色譜法。其流動相通常是弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。由於矽羥基活性點在矽膠表面常按一定幾何規律排列，因此吸附色譜法用於結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法。如農藥異構體分離，石油中烷、烯、芳烴的分離。
分配色譜法 基於樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實現分離的液相色譜分離模式。分配色譜法原本是基於樣品分子在包覆於惰性載體（基質）上的固定相液體和流動相液體之間的分配平衡的色譜法，因此也稱液–液分配色譜法。因為作固定相的液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，不大被采用。後來發展起來的鍵合固定相以化學鍵合的方法將功能分子結合到惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去瞭。這種化學鍵合型固定相是HPLC中最常用的固定相，大約占HPLC固定相的3/4。極性鍵合固定相鍵合在載體表面的功能分子具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團。非極性鍵合固定相鍵合在載體表面的功能分子具有烷基、苯基等非極性基團。如最常用的ODS柱或C18柱就是將十八烷基三氯矽烷通過化學反應與矽膠表面的矽羥基結合，在矽膠表面形成化學鍵合態的十八烷基，其極性很小。
凝膠色譜法 以多孔性物質作固定相，樣品分子受固定相孔徑大小的影響而達到分離的液相色譜分離模式。樣品分子與固定相之間不存在相互作用力（吸附、分配和離子交換等），因而凝膠色譜又常被稱作體積排斥色譜法、空間排阻色譜法、分子篩色譜法等。比固定相孔徑大的溶質分子不能進入孔內，迅速流出色譜柱，不能被分離；比固定相孔徑小的分子才能進入孔內而停留。溶質分子體積越小，進入固定相孔內的概率越大，於是在固定相中停留（保留）的時間也就越長。
儀器 圖1是具有基本配置的液相色譜儀的流程圖。其工作過程是：輸液泵將流動相以穩定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進樣器將樣品導入，流動相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數或吸附力大小的不同而被分離，並依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至數據系統記錄、處理或保存。
圖1 液相色譜儀流程1 流動相容器 2 高壓輸液泵 3 進樣器 4 色譜柱 5 檢測器 6 工作站 7 廢液容器
輸液泵 高壓輸液泵是液相色譜儀的關鍵部件，其作用是將流動相以穩定的流速或壓力輸送到色譜系統。如果有在線脫氣裝置，流動相則先經過脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩定性直接關系到分析結果的重現性和準確性。一般的分析工作中，流動相的流量在0.5～2毫升/分，輸液泵的最大流量一般為5～10毫升/分。輸液泵的流量控制精度通常要求小於±0.5%，可配套脈沖抑制器。高效液相色譜法中泵的輸出壓力要達到30～60兆帕的高壓。為瞭快速更換溶劑和適於梯度洗脫，泵的死體積通常要求小於0.5毫升。泵的結構材料應耐化學腐蝕。
輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜法來說，輸液泵的流量穩定性更為重要，這是因為流速的變化會引起溶質的保留值變化，而保留值是色譜定性的主要依據之一。因此，恒流泵的應用更廣泛。
輸液泵按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動註射泵、單活塞往復泵、雙活塞往復泵和往復式隔膜泵。
梯度洗脫裝置 在進行多成分的復雜樣品的分離時，經常會碰到前面的一些成分分離不完全，而後面的一些成分分離度太大且出峰很晚和峰型較差等問題。為瞭使保留時間相差很大的多種成分在合理的時間內全部洗脫並達到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術。液相色譜法中通常所說的梯度洗脫是指流動相有梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。線性梯度是在某一段時間內連續而均勻增加的流動相強度；階梯梯度是直接從某一低強度的流動相改變為另一較高強度的流動相。
梯度洗脫時，流動相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合後送到色譜儀中。因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。
根據溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。高壓梯度一般隻用於二元梯度，即用兩個高壓泵分別按設定的比例輸送兩種溶液至混合器。混合器在泵之後，即兩種溶液是在高壓狀態下進行混合的。高壓梯度系統的主要優點是，隻要通過梯度程序控制器控制每臺泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易於實現自動控制。其主要缺點是使用瞭兩臺高壓輸液泵，使儀器價格昂貴，故障率也相對較高，而且隻能實現二元梯度操作。
低壓梯度隻需一個高壓泵，與等度洗脫輸液系統相比，就是在泵前安裝瞭一個比例閥，混合就在比例閥中完成。因為比例閥在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常要配置在線脫氣裝置。
色譜柱 實現分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩定。柱性能與柱結構、填料特性、填充質量和使用條件有關。色譜柱填料是經過制備處理後，用於填充色譜柱的顆粒，通常是3～10微米粒徑的球形顆粒。色譜柱管是裡面拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜柱尺寸為內徑4.6毫米，長250毫米。色譜柱結構見圖2。
圖2 色譜柱結構示意圖
檢測器 用來連續監測經色譜柱分離後的柱流出物的組成和含量變化的裝置。檢測器利用溶質的某一物理或化學性質與流動相有差異的原理，當溶質從色譜柱流出時，會導致流動相背景值發生變化，從而在色譜圖上以色譜峰的形式記錄下來。例如，紫外–可見光(UV–VIS)檢測器就是基於朗伯–比爾定律，即被測組分對紫外線或可見光可吸收，且吸收程度與組分濃度成正比。很多有機分子都具紫外或可見光吸收基團，有較強的吸收紫外或可見光能力，因此UV–VIS檢測器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應用范圍。由於UV–VIS對環境溫度、流速、流動相組成等的變化不是很敏感，所以還能用於梯度洗脫。一般的液相色譜儀都配置有UV–VIS檢測器。常用檢測器還有示差折光檢測器、熒光檢測器和蒸發光散射檢測器(ELSD)。見紫外–可見分光光度法、熒光分析。